Các chủng nấm men phân lập từ men cơm rượu phát triển ở ethanol 12%
Ethanol ngày càng trở nên quan trọng và được ứng dụng nhiều trong sản xuất một số thành phần trong thuốc, nhiên liệu sinh học, dung môi và một số ngành công nghiệp khác,... Tình trạng biến đổi khí hậu toàn cầu trong những năm gần đây đã đặt ra những thách thức lớn cho ngành công nghiệp sản xuất ethanol với việc sử dụng các vi sinh vật lý tưởng có thể chịu nhiệt và lên men mạnh. Sự phát triển của vi sinh vật chịu nhiệt ứng dụng cho các công nghệ sản xuất ethanol là hướng đi tiềm năng và dự báo sẽ có sự tăng trưởng cao.
Bên cạnh tính ứng dụng thiết thực, việc nghiên cứu tính đa dạng di truyền của các chủng nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic bản địa nhằm đánh giá, tiến đến khai thác sử dụng nguồn gen nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic bản địa một cách hiệu quả nhất, cũng như tập hợp nguồn tài nguyên di truyền vi sinh vật ứng dụng trong công nghệ lên men vi sinh, không những góp phần tham gia phát triển kinh tế xã hội mà còn tạo dựng môi trường bền vững trong khu vực. Nhóm nghiên cứu do Cơ quan chủ trì Trường Đại học Cần Thơ phối hợp với Chủ nhiệm đề tài PGS.TS Ngô Thị Phương Dung cùng thực hiện. Với mục tiêu nhằm thiết lập và phát triển bộ sưu tập đa dạng di truyền nguồn giống vi sinh vật chịu nhiệt hữu ích được tuyển chọn và thử nghiệm ứng dụng định hướng trong công nghệ sản xuất sản phẩm lên men ethanol, acid lactic và acid acetic.
Sau thời gian nghiên cứu, đề tài đã mang lại những kết quả như sau:
1. Đã nghiên cứu thử nghiệm, tuyển chọn được 225 chủng gồm nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic có tính chịu nhiệt và có khả năng lên men ở nhiệt độ cao.
- Từ các nguồn mẫu nguyên liệu khác nhau như men rượu, men cơm rượu, ca cao, hoa cây ăn quả, trái cây chín, mẫu từ cây có múi, mía và đất trồng mía, phụ phẩm nông nghiệp, sản phẩm lên men, rỉ đường và men bia, được thu thập ở các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, tổng cộng có 762 chủng vi sinh vật được phân lập thuần có khả năng lên men ở 30 độ C, trong đó gồm có 387 chủng nấm men, 197 chủng vi khuẩn lactic và 178 chủng vi khuẩn acetic. Các đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng vi sinh vật đã được xác định.
- Qua các thử nghiệm về khả năng chịu nhiệt, chịu cồn, chịu acid, khả năng sinh bacteriocin, hoạt tính lên men, tính kháng khuẩn, kết quả sơ tuyển và chọn lọc được 225 chủng vi sinh vật có tính chịu nhiệt và thể hiện khả năng lên men ở nhiệt độ trên 37 độ C, trong đó gồm có 114 chủng nấm men chịu nhiệt, 54 chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt, 57 chủng vi khuẩn acetic chịu nhiệt. Một số chủng vi sinh vật có khả năng phát triển ở 47 độ C.
2. Đã nghiên cứu xác định được tên loài, mối liên quan di truyền và xây dựng cơ sở dữ liệu nguồn gen của các chủng vi sinh vật chịu nhiệt có hoạt tính lên men cao được tuyển chọn.
- Tổng cộng có 59 chủng chịu nhiệt có hoạt tính lên men cao được tuyển chọn, trong đó gồm 23 chủng nấm men, 16 chủng vi khuẩn lactic và 20 chủng vi khuẩn acetic, đã được phân tích trình tự DNA xác định tên loài và khảo sát mối liên quan di truyền.
- Đã thiết lập được các cây phân loại di truyền của 59 chủng chịu nhiệt tuyển chọn, được xây dựng bằng sử dụng phần mềm MEGA 6, phương pháp phân tích Maximum Likelihood và chỉ số Bootstrap với 1000 lần lặp lại.
- Một số loài nấm men chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae; Candida tropicalis và Candida glabrata. Hai loài vi khuẩn lactic chịu nhiệt tiêu biểu lên men tốt là Lactobacillus casei và Lactobacillus plantarum. Một số loài vi khuẩn acetic chủ yếu là Acetobacter sicerae, Acetobacter tropicalis, Acetobacter senegalensis.
- Đã xây dựng được cơ sở dữ liệu nguồn gen của 23 chủng nấm men, 16 chủng vi khuẩn lactic và 20 chủng vi khuẩn acetic, gồm tổng hợp các thông tin về: đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa; khả năng chịu nhiệt; khả năng chịu ethanol, khả năng chịu acid; khả năng lên men và khả năng đồng hóa các nguồn carbon; trình tự DNA và tên loài.
3. Đã xây dựng được quy trình tồn trữ bằng phương pháp bảo quản lạnh sâu và đánh giá nguồn gen vi sinh vật chịu nhiệt sau tồn trữ.
- Xây dựng được ba quy trình tồn trữ nấm men, vi khuẩn lactic, vi khuẩn acetic ở điều kiện -20 độ C và -80 độ C.
- Sau 12 tháng tồn trữ, 23 chủng nấm men chịu nhiệt tuyển chọn vẫn phát triển tốt ở nhiệt độ 37 độ C và 40 độ C, và vẫn thể hiện khá ổn định hoạt tính lên men ethanol trong môi trường YPD 16% glucose.
- Đối với 16 chủng vi khuẩn lactic chịu nhiệt tuyển chọn, thời gian tồn trữ dài nhất ở điều kiện -20 độ C và -80 độ C mà vẫn đảm bảo hoạt tính là 9 tháng. Ở -80 độ C khả năngchịu nhiệt của vi khuẩn lactic duy trì tốt hơn nhưng khả năng sinh acid lactic kém hơn so với tồn trữ ở -20 độ C.
- Khả năng chịu nhiệt và hoạt tính lên men của 20 chủng acetic chịu nhiệt tuyển chọn có thể duy trì ổn định trong thời gian tồn trữ là sau 9 tháng ở điều kiện -20 độ C và -80 độ C. Sau 12 tháng tồn trữ thì khả năng sinh acid acetic của đa số chủng vi khuẩn acetic giảm mạnh ở cả hai mức nhiệt độ tồn trữ là -20 độ C và -80 độ C.
4. Đã nghiên cứu xác định được điều kiện và xây dựng quy trình lên men ethanol, acid lactic, acid acetic quy mô phòng thí nghiệm sử dụng các chủng vi sinh vật chịu nhiệt tuyển chọn.
- Đối với nghiên cứu ứng dụng nấm men chịu nhiệt, đã xây dựng quy trình lên men rượu vang khóm và quy trình sản xuất ethanol. Chủng Saccharomyces cerevisiae Y8 thể hiện khả năng lên men mạnh nhất ở 37 độ C từ dịch khóm. Điều kiện lên men rượu vang khóm thích hợp sử dụng chủng S. cerevisiae Y8 ở 37 độ C là: hàm lượng đường 213 g/L, thời gian 6 ngày và mật số nấm men 106 tế bào/mL. Trong thử nghiệm sản xuất ethanol từ rỉ đường, ở 37 độ C và 40 độ C, chủng Saccharomyces serevisiae Y81 thể hiện lên men mạnh nhất. Điều kiện lên men ethanol từ rỉ đường thích hợp sử dụng chủng S. cerevisiae Y81 ở 37 độ C là: hàm lượng đường 186 g/L, thời gian 6 ngày và mật số nấm men là 107 tế bào/mL.
- Đối với nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn lactic chịu nhiệt, đã xây dựng quy trình sản xuất acid lactic và quy trình sản xuất chế phẩm vi khuẩn lactic. Chủng Lactobacillus casei L9 thể hiện có khả năng sinh acid lactic cao nhất ở 39 độ C và 41 độ C. Điều kiện lên men acid lactic thích hợp sử dụng chủng L. casei L9 ở 39°C là: nồng độ glucose bổ sung 6% (w/v), giá trị pH ban đầu 6,53 và nồng độ giống chủng 2,33% (v/v), hàm lượng acid lactic sinh ra đạt 17,90 g/L. Chủng Lactobacillus plantarum L54 thể hiện có tính kháng khuẩn mạnh nhất. Điều kiện sản xuất chế phẩm sinh khối vi khuẩn lactic thích hợp từ môi trường nước chua tàu hũ ở 39 độ C là: glucose 5,99% (w/v), nồng độ giống chủng 6,37% (v/v), pH ban đầu là 6,0.
- Đối với nghiên cứu ứng dụng vi khuẩn acetic chịu nhiệt, đã xây dựng quy trình sản xuất acid acetic và quy trình sản xuất giấm sơ-ri. Điều kiện lên men acid acetic thích hợp từ môi trường YPGD sử dụng chủng Acetobacter tropicalis A18 ở 39 độ C là: nồng độ ethanol 4,32%, pH 4,0 và nồng độ giống chủng là 105 tế bào/mL. Điều kiện sản xuất giấm sơ-ri thích hợp sử dụng chủng Acetobacter senegalensis A28 ở 39 độ C là: nồng độ cơ chất là 20,26°Brix, pH 6,5 và nồng độ giống chủng 106 tế bào/mL.
5. Đã nghiên cứu ứng dụng các chủng nấm men và vi khuẩn chịu nhiệt lên men ethanol, acid lactic và acid acetic quy mô pilot định hướng sử dụng công nghiệp.
- Đã thử nghiệm được quy trình lên men ethanol và lên men rượu vang khóm ở quy mô 2 L, 20 L và 50 L. Kết quả lên men rượu vang khóm 2 L ở 35 độ C, 37 độ C và 40 độ C cho thấy độ cồn và hiệu suất cao nhất đạt ở 37 độ C, lần lượt là 9,02% (v/v) và 87,87(%); ở thể tích 50 L 37 độ C sử dụng S. cerevisiae Y8 kết quả đạt độ cồn 10,78% (v/v) và hiệu suất 86,82 (%). Lên men ethanol từ dịch ép mía ở 37 độ sử dụng S. cerevisiae Y8 thể tích 2 L đạt độ cồn 8,31% (v/v) và hiệu suất 89,57%; thể tích 20 L đạt độ cồn 8,61% (v/v) và hiệu suất 87,22%; thể tích 50 L đạt độ cồn 8,39% (v/v) và hiệu suất 86,75%. Lên men ethanol từ dịch rỉ đường ở 37 độ C sử dụng S. cerevisiae Y81 thể tích 2 L đạt độ cồn 7,80% (v/v) và hiệu suất 83,40%; thể tích 20 L đạt độ cồn 7,97% (v/v) và hiệu suất 85,55%; thể tích 50 L đạt độ cồn 8,10% (v/v) và hiệu suất 85,98%.
- Đã thử nghiệm được quy trình lên men acid lactic ở quy mô 2 L, 20 L và 50 L. Lên men acid lactic sử dụng L. casei L9 ở 39 độ C thể tích 2 L đạt hàm lượng acid lactic 26,40 g/L và hiệu suất 87,53%; thể tích 20 L đạt hàm lượng acid lactic 29,03 g/L và hiệu suất 84,01%; thể tích 50 L đạt hàm lượng acid lactic 28,35 g/L và hiệu suất 85,37%. Chủng L. plantarum L54 lên men acid lactic từ nước chua tàu hũ ở 39 độ C, sinh khối vi khuẩn được ổn định và đạt cao nhất, cụ thể là 2,37g/L ở 2 L, 1,87 g/L ở 20 L và 1,685 g/L ở 50 L; bột gạo là chất mang phù hợp với chủng L. plantarum L54.
- Đã thử nghiệm được quy trình lên men acid acetic và giấm sơ-ri ở quy mô 2 L, 20 L và 50 L. Sản xuất acid acetic sử dụng chủng A. tropicalis A18 thể tích 2 L và 20 L cho hàm lượng acid acetic đạt cao nhất ở 37 độ C so với kết quả ở 35 độ C và 39 độ C; với thể tích 50 L ở 37 độ C, hàm lượng acid acetic đạt 2,40% (w/v) và hiệu suất đạt 91,89%. Lên men giấm sơ ri ở 37 độ C sử dụng chủng A. senegalensis A28, hàm lượng acid đạt 8,4% (w/v) ở 2 L, 5,6% (w/v) ở 20 L và ở 50 L, hàm lượng acid cao nhất đạt được là 3,68% (w/v) và hiệu suất đạt 87,20%.
6. Các kết quả khác:
Nhiệm vụ đã tham gia đào tạo 03 Tiến sĩ, 07 Thạc sĩ và 64 cử nhân Công nghệ sinh học và Vi sinh vật. Đã công bố 20 bài báo toàn văn trong các Tạp chí quốc tế, Tạp chí trong nước, và 30 bài báo cáo tóm tắt trong các hội nghị quốc tế và khu vực. Đã tổ chức 3 hội thảo khoa học. Đã góp phần hỗ trợ cho 10 lượt cán bộ khoa học và 10 lượt sinh viên của cơ quan chủ trì nhiệm vụ, cơ quan hợp tác thực hiện nhiệm vụ đi tập huấn, học tập kinh nghiệm, tham dự hội thảo và thực hiện nghiên cứu tại đơn vị đối tác Nhật Bản.
7. Hiệu quả hợp tác quốc tế với đối tác Nhật Bản:
Quá trình hợp tác với đối tác Nhật Bản được thực hiện thuận lợi, các hoạt động phối hợp rất tốt và được triển khai theo đúng tiến độ các nội dung nghiên cứu trong Bản thỏa thuận hợp tác. Đối tác Nhật Bản rất nhiệt tình phối hợp và hỗ trợ một phần kinh phí trong việc thực hiện các nghiên cứu tại các phòng thí nghiệm của trường đối tác, tạo mọi điều kiện thuận lợi cho nhóm nghiên cứu được tiếp cận các thiết bị và phương pháp nghiên cứu hiện đại về vi sinh vật chịu nhiệt, công nghệ lên men vi sinh vật, enzyme và các kỹ thuật sinh học phân tử (PCR, công nghệ chuyển gen, giải trình tự, kỹ thuật định danh TOF/MS...). Qua đó đã góp phần rút ngắn thời gian nghiên cứu và đạt hiệu quả cao, cũng như đã góp phần bồi dưỡng đào tạo cán bộ khoa học và công nghệ có trình độ cao và năng lực nghiên cứu khoa học chuyên sâu, đủ sức tiến hành các hợp tác nghiên cứu quốc tế trong lĩnh vực này. Kết quả nhiệm vụ và quá trình hợp tác đã được phía đối tác Nhật Bản xác nhận, đánh giá rất cao và khẳng định có hướng tiếp tục cùng hợp tác trong dự án mới.
*Có thể tìm đọc báo cáo kết quả nghiên cứu (mã số 14236/2017) tại Cục Thông tin KHCNQG.